什么是凝膠色譜柱

　　凝膠色譜柱是一種用于分離生物大分子的柱層析技術(shù)，它基于形狀選擇和分子篩分離原理，在分子量、電荷、極性和親疏水性等方面具有較大的分辨能力和選擇特異性。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等復(fù)雜生物大分子的分離純化及結(jié)構(gòu)表征，是生物化學(xué)、生物物理、生物醫(yī)學(xué)等學(xué)科中重要的工具。

　　凝膠色譜柱按照凝膠材料的類(lèi)型和粒徑大小可分為不同類(lèi)型，包括聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)、瓊脂糖凝膠、超高分子量聚乙烯醇(PVA)凝膠、流動(dòng)相中含有聚合物微球的凝膠等。這些凝膠具備不同的分子篩分離能力和通透性，可根據(jù)需要靈活選擇。

　　宸喬提供的Supdex30pg、Supdex75pg、Supdex 200pg為新一代凝膠過(guò)濾介質(zhì)，由葡聚糖與高交聯(lián)度瓊脂糖共價(jià)結(jié)合而成，高交聯(lián)度瓊脂糖賦予了介質(zhì)較高的耐壓性，介質(zhì)中分布的葡聚糖實(shí)現(xiàn)了其對(duì)不同大小蛋白和多肽的高度分離，能夠?qū)崿F(xiàn)高流速下高分辨率的精細(xì)分離純化實(shí)驗(yàn)。

　　基礎(chǔ)理論：

　　分子篩效應(yīng)：凝膠色譜根據(jù)分子大小來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。大分子無(wú)法進(jìn)入凝膠的小孔徑，因此沿顆粒外部迅速通過(guò)，小分子則可以穿透這些孔隙，滯留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)分子按大小分離的效果。

　　分離機(jī)制：樣品中的不同大小分子在通過(guò)凝膠色譜柱時(shí)，會(huì)按照其分子尺寸被分離。大分子因無(wú)法進(jìn)入所有凝膠孔徑而首先流出，小分子則因深入孔徑而滯后流出。

　　組成結(jié)構(gòu)：

　　柱體積：指裝填凝膠后柱的實(shí)際使用容積，影響分離效果和分辨率。

　　填料：凝膠色譜柱的分離性能很大程度上取決于填料的性質(zhì)，如粒徑、孔徑分布等。常見(jiàn)的填料有交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺等，具有不同的分離范圍和適用性。

　　應(yīng)用范圍：

　　1. 蛋白質(zhì)純化：凝膠色譜柱可用于分離純化特定分子量、極性、親疏水性或電荷的蛋白質(zhì)。例如，離子交換色譜柱可用于根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，而分子篩色譜則可根據(jù)分子大小進(jìn)行分離。

　　2. 酶學(xué)研究：酶活性通常與其分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相關(guān)，因此凝膠色譜柱可用于分離純化和表征各種酶，包括氧化酶、酰胺酶、葡萄糖酸脫氫酶等。

　　3. 核酸純化：它也可用于純化DNA、RNA以及相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合物。例如，凝膠超濾色譜柱可用于分離純化含有特定大小DNA分子的混合溶液，而脫鹽凝膠色譜柱可用于分離DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物。

　　4. 多糖分析：它可用于分離分子量相近的多糖分子，如分離賴(lài)氨酸聚糖、明膠、甘露聚糖等。

　　凝膠色譜柱是一種分離生物大分子(如蛋白質(zhì)、多肽、核酸等)的常用方法。在分離過(guò)程中，生物大分子混入流動(dòng)相中，通過(guò)不同的親和性與固定在色譜柱中的凝膠粒子相互作用而實(shí)現(xiàn)分離。操作過(guò)程如下：

　　一、準(zhǔn)備工作：

　　1.檢查色譜柱是否安裝在專(zhuān)業(yè)色譜機(jī)上并插好了輸液端口;

　　2.整體清潔柱外表和輸液端口;

　　3.配置所需緩沖液，并過(guò)濾去雜質(zhì);

　　4.調(diào)整專(zhuān)業(yè)色譜機(jī)參數(shù)，如流速、檢測(cè)方式(如紫外光譜)、樣品注入量等。

　　二、樣品制備與加載：

　　1.根據(jù)樣品特性調(diào)整緩沖液pH值并稀釋;

　　2.樣品加入吸附管中，使用低爆粘度管口接凝膠色譜柱頂部端口;

　　3.在柱頂注入適量緩沖液，待液體滲透后加入樣品。

　　三、洗脫：

　　1.待樣品全部加完，緩慢注入適量緩沖液進(jìn)行洗脫;

　　2.通過(guò)檢測(cè)尋找目標(biāo)物質(zhì)，做到用盡緩沖液;

　　3.延長(zhǎng)洗脫時(shí)間以沉淀剩余廢物。

　　四、洗脫和回收：

　　1.將樣品分進(jìn)多個(gè)樣品管中，不同管內(nèi)含有不同樣品;

　　2.根據(jù)需要洗滌外部顆粒物，還原道特定化合物;

　　3.用標(biāo)準(zhǔn)梯度洗脫樣品并收集目標(biāo)物;

　　4.測(cè)定樣品的吸收率，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

　　凝膠色譜柱是一種重要的生物分離純化技術(shù)，其應(yīng)用廣泛，用于生物大分子的分離純化及表征，在生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。